ПЛР відома вже понад 30 років, її використовують у багатьох галузях молекулярної біології, в археології та генетиці. Полімеразна ланцюгова реакція застосовується для встановлення батьківства, діагностування різноманітних інфекційних хвороб. Її суть полягає у виділенні малих концентрацій фрагментів ДНК у біоматеріалі та збільшенні їх для постановки діагнозу.
Що таке ПЛР
Точний метод діагностики дозволяє виявити спадкові, інфекційні захворювання у гострій та хронічній стадіях, на етапі інкубації вірусів та бактерій. ПЛР є специфічним аналізом, він дуже точний і не може дати хибнопозитивний результат. Діагностика допомагає знайти збудника у гені, отриманому з біоматеріалу.
Аналіз дає точний результат при встановленні статевих та прихованих інфекцій, венеричних захворювань. Він передбачає маніпуляції з нуклеїновими кислотами, щоб встановити батьківство, клонувати чи вивести нові гени. Діагностика універсальна, високочутлива, не супроводжується перехресними реакціями. Для аналізу придатний будь-який біоматеріал пацієнта.
Де і навіщо застосовується метод ПЛР
Застосовувати ланцюгову полімеразну реакцію можна у різних галузях та наукових експериментах. Особливості використання:
- криміналістика – для порівняння генетичних матеріалів;
- встановлення батьківства – для встановлення спорідненості між дитиною та передбачуваними батьками;
- медична діагностика – прискорення та полегшення діагностики спадкових, вірусних захворювань;
- персоналізована медицина – встановлення токсичності чи алергенності ліків;
- клонування генів – щоб одержати білків, які у сільському господарстві, медицині;
- секвенування ДНК – виявлення родинних ділянок фрагментів ланцюга виявлення генетичних схильностей до хвороб;
- мутагенез – внесення змін до нуклеотидної послідовності.
Що виявляє дослідження
В організмі часто присутні приховані інфекції, які тривалий час не виявляють себе. Метод ланцюгової полімеразної реакції допомагає їх встановити та виявити. Патології, які виявляються під час аналізу:
- гепатит;
- кандидоз;
- уреаплазмоз статевих органів;
- хламідіоз;
- папіломавірусна інфекція;
- герпес;
- ракові клітини;
- мікоплазмоз;
- бактеріальний вагіноз;
- трихомоніаз;
- інфекційний мононуклеоз;
- гормональне тло;
- СНІД, ВІЛ.
Досліджуваний біоматеріал
Реакція ПЛР проводиться з дослідженням біоматеріалу, з якого виділяють ДНК чи РНК. Для аналізу беруться біологічні рідини та середовища людини:
- сеча – для вивчення інфекційного ураження сечостатевого тракту, сечовивідних органів;
- мокротиння – використовується при діагностиці туберкульозу, респіраторних форм хламідіозу, мікоплазмозу;
- сік простати, спинномозкова, плевральна, суглобова, навколоплідна рідини, слина – за медичними показаннями;
- епітеліальні зіскрібки (мазки) зі слизових оболонок – для діагностики гонореї, мікоплазмозу, хламідіозу, уреаплазмозу, трихомоніазу, герпесу, гарднереллезу;
- біоптати дванадцятипалої кишки, шлунка – для виявлення гелікобактерної інфекції;
- плазма, кров, сироватка – виявлення вірусів гепатиту, герпесу, цитомегаловірусу, ВІЛ, дослідження генів.
Методика проведення дослідження методом ПЛР
Ланцюгова полімеразна реакція використовується для проведення аналізів та наукових експериментів. Виділяють техніки її проведення:
- З зворотною транскрипцією – для ампліфікації (збільшення обсягу), виділення чи ідентифікації послідовності генів.
- Інвертована – визначення сусідніх послідовностей після вставки ДНК в геном. Вона проводиться, якщо відома невелика ділянка всередині потрібної послідовності.
- Вкладена – послідовно проводять дві реакції.
- Асиметрична – проводиться для ампліфікації одного з кіл вихідної ДНК для секвенування, гібридизаційного аналізу.
- Кількісна – ПЛР у часі, використовується спостереження за виміром конкретного продукту у циклі реакції.
- Ступінчаста – зменшує вплив неспецифічного зв’язування праймерів.
- Груп-специфічна – використовуються консервативні праймери.
Підготовка до процедури
Аналіз крові на ПЛР передбачає, що матеріал для дослідження не може бути забруднений. Це дозволить не одержати необ’єктивний результат. Заходи підготовки:
- приготувати стерильні контейнери для матеріалу;
- здавати аналіз натще вранці;
- не виявляти статеву активність протягом доби до дослідження.
Розшифровка результатів
Результати будуть відомі через 1,5-2 дні після процедури. Іноді цей період займає менше часу. Розшифровка показників:
- Позитивна ПЛР – в організмі є ДНК або РНК збудника.
- Негативна – у біоматеріалі відсутній шуканий інфекційний штам.
Метод дослідження відрізняється високою точністю, чутливістю та специфічністю. Він допомагає визначити відсутність або наявність інфекції в організмі, вказати тип захворювання, виявити сліди збудника навіть за низького вмісту ДНК мікробів у біоматеріалі.
Кількісний та якісний аналіз ПЛР
У деяких випадках проводять кількісне визначення мікроорганізмів, що є актуальним при захворюваннях, викликаних умовними патогенами. Вони виявляють свою негативну дію при надмірній кількості. Аналіз важливий для вибору терапевтичної практики з метою контролю за лікуванням вірусів імунодефіциту людини, гепатиту.
Якісний аналіз допомагає визначити наявність конкретного вірусу чи інфекційного збудника. Для цього проводиться порівняння фрагментів ДНК із зразками, що уражені конкретним геном – гепатитом, герпесом. Дослідження показує наявність або відсутність патогенів у крові, результатом є показання – «виявлено» або «не виявлено».
Якісний тест має чутливість. Це означає, що наявність вірусу в малій концентрації не дасть себе виявити. Для контролю необхідно використовувати максимально чутливу систему – не нижче 50 МО/мл.
