Полімеразна ланцюгова реакція – опис, цілі та методи дослідження

ПЛР відома вже понад 30 років, її використовують у багатьох галузях молекулярної біології, в археології та генетиці. Полімеразна ланцюгова реакція застосовується для встановлення батьківства, діагностування різноманітних інфекційних хвороб. Її суть полягає у виділенні малих концентрацій фрагментів ДНК у біоматеріалі та збільшенні їх для постановки діагнозу.

Що таке ПЛР

Точний метод діагностики дозволяє виявити спадкові, інфекційні захворювання у гострій та хронічній стадіях, на етапі інкубації вірусів та бактерій. ПЛР є специфічним аналізом, він дуже точний і не може дати хибнопозитивний результат. Діагностика допомагає знайти збудника у гені, отриманому з біоматеріалу.

Аналіз дає точний результат при встановленні статевих та прихованих інфекцій, венеричних захворювань. Він передбачає маніпуляції з нуклеїновими кислотами, щоб встановити батьківство, клонувати чи вивести нові гени. Діагностика універсальна, високочутлива, не супроводжується перехресними реакціями. Для аналізу придатний будь-який біоматеріал пацієнта.

Де і навіщо застосовується метод ПЛР

Застосовувати ланцюгову полімеразну реакцію можна у різних галузях та наукових експериментах. Особливості використання:

  • криміналістика – для порівняння генетичних матеріалів;
  • встановлення батьківства – для встановлення спорідненості між дитиною та передбачуваними батьками;
  • медична діагностика – прискорення та полегшення діагностики спадкових, вірусних захворювань;
  • персоналізована медицина – встановлення токсичності чи алергенності ліків;
  • клонування генів – щоб одержати білків, які у сільському господарстві, медицині;
  • секвенування ДНК – виявлення родинних ділянок фрагментів ланцюга виявлення генетичних схильностей до хвороб;
  • мутагенез – внесення змін до нуклеотидної послідовності.

Полімеразна ланцюгова реакція - опис, цілі та методи дослідження

Що виявляє дослідження

В організмі часто присутні приховані інфекції, які тривалий час не виявляють себе. Метод ланцюгової полімеразної реакції допомагає їх встановити та виявити. Патології, які виявляються під час аналізу:

  • гепатит;
  • кандидоз;
  • уреаплазмоз статевих органів;
  • хламідіоз;
  • папіломавірусна інфекція;
  • герпес;
  • ракові клітини;
  • мікоплазмоз;
  • бактеріальний вагіноз;
  • трихомоніаз;
  • інфекційний мононуклеоз;
  • гормональне тло;
  • СНІД, ВІЛ.

Досліджуваний біоматеріал

Реакція ПЛР проводиться з дослідженням біоматеріалу, з якого виділяють ДНК чи РНК. Для аналізу беруться біологічні рідини та середовища людини:

  • сеча – для вивчення інфекційного ураження сечостатевого тракту, сечовивідних органів;
  • мокротиння – використовується при діагностиці туберкульозу, респіраторних форм хламідіозу, мікоплазмозу;
  • сік простати, спинномозкова, плевральна, суглобова, навколоплідна рідини, слина – за медичними показаннями;
  • епітеліальні зіскрібки (мазки) зі слизових оболонок – для діагностики гонореї, мікоплазмозу, хламідіозу, уреаплазмозу, трихомоніазу, герпесу, гарднереллезу;
  • біоптати дванадцятипалої кишки, шлунка – для виявлення гелікобактерної інфекції;
  • плазма, кров, сироватка – виявлення вірусів гепатиту, герпесу, цитомегаловірусу, ВІЛ, дослідження генів.

Методика проведення дослідження методом ПЛР

Ланцюгова полімеразна реакція використовується для проведення аналізів та наукових експериментів. Виділяють техніки її проведення:

  1. З зворотною транскрипцією – для ампліфікації (збільшення обсягу), виділення чи ідентифікації послідовності генів.
  2. Інвертована – визначення сусідніх послідовностей після вставки ДНК в геном. Вона проводиться, якщо відома невелика ділянка всередині потрібної послідовності.
  3. Вкладена – послідовно проводять дві реакції.
  4. Асиметрична – проводиться для ампліфікації одного з кіл вихідної ДНК для секвенування, гібридизаційного аналізу.
  5. Кількісна – ПЛР у часі, використовується спостереження за виміром конкретного продукту у циклі реакції.
  6. Ступінчаста – зменшує вплив неспецифічного зв'язування праймерів.
  7. Груп-специфічна – використовуються консервативні праймери.

Полімеразна ланцюгова реакція - опис, цілі та методи дослідження

Підготовка до процедури

Аналіз крові на ПЛР передбачає, що матеріал для дослідження не може бути забруднений. Це дозволить не одержати необ'єктивний результат. Заходи підготовки:

  • приготувати стерильні контейнери для матеріалу;
  • здавати аналіз натще вранці;
  • не виявляти статеву активність протягом доби до дослідження.

Розшифровка результатів

Результати будуть відомі через 1,5-2 дні після процедури. Іноді цей період займає менше часу. Розшифровка показників:

  1. Позитивна ПЛР – в організмі є ДНК або РНК збудника.
  2. Негативна – у біоматеріалі відсутній шуканий інфекційний штам.

Метод дослідження відрізняється високою точністю, чутливістю та специфічністю. Він допомагає визначити відсутність або наявність інфекції в організмі, вказати тип захворювання, виявити сліди збудника навіть за низького вмісту ДНК мікробів у біоматеріалі.

Кількісний та якісний аналіз ПЛР

У деяких випадках проводять кількісне визначення мікроорганізмів, що є актуальним при захворюваннях, викликаних умовними патогенами. Вони виявляють свою негативну дію при надмірній кількості. Аналіз важливий для вибору терапевтичної практики з метою контролю за лікуванням вірусів імунодефіциту людини, гепатиту.

Якісний аналіз допомагає визначити наявність конкретного вірусу чи інфекційного збудника. Для цього проводиться порівняння фрагментів ДНК із зразками, що уражені конкретним геном – гепатитом, герпесом. Дослідження показує наявність або відсутність патогенів у крові, результатом є показання – «виявлено» або «не виявлено».

Якісний тест має чутливість. Це означає, що наявність вірусу в малій концентрації не дасть себе виявити. Для контролю необхідно використовувати максимально чутливу систему – не нижче 50 МО/мл.

Полімеразна ланцюгова реакція - опис, цілі та методи дослідження

Ціна

Залежно від виду дослідження відрізняється вартість проведення ПЛР, у комплексі вони дешевші. Орієнтовні ціни по Москві:

Назва аналізу

Вартість, рублів

Інфекції, що передаються статевим шляхом

400

Віруси Епштейна-Барра, папіломи людини, герпесу, цитомегаловірусу

300-500

Якісний аналіз гепатиту

650

Кількісний аналіз гепатиту

2000

Антитіла до вірусів гепатиту, сумарні та імуноглобуліни

450

Хелікобактер пилори

350

Антигени та антитіла до ВІЛ

400

Якісні РНК ВІЛ

3500

Кількісні РНК ВІЛ

11500

Відео

EuroMD
Додати коментар